Kultura humanih gameta i zametaka

Objavljeno: 29.10.2018. 13:30

Uvjeti kultivacije humanih gameta i zametaka in vitro odlučujući su činitelji uspjeha metoda medicinski pomognute oplodnje (MPO). Metode MPO-a podrazumijevaju sve tehnike kojima se nastoji povećati vjerojatnost zanošenja bračnih parova s problemom neplodnosti, a ovih parova u populaciji ima oko 15-18%. Metodama MPO-a se liječi između 60 i 70% svih uzroka bračne neplodnosti, a one obuhvaćaju postupke intrauterine (IUI) ili intratubarne (ITI) inseminacije, izvantjelesnu oplodnju i prijenos zametaka u maternicu žene (od eng. in vitro fertilization and embryo transfer, IVF/ET) te izvantjelesnu oplodnju metodom injiciranja spermija u citoplazmu jajne stanice (od eng. intracytoplasmic sperm injection, ICSI).

Kultura humanih gameta i zametaka primarna je, kratkotrajna kultura koju čine čvrsta podloga (četverozdenačne ploče ili petrijeve zdjelice), okoliš (atmosferski i temperaturni) i hranjivi medij. Uspješnost kultivacije in vitro ponajprije je ugrožena suboptimalnim uvjetima kultivacije koji dovode do nepravilanog razvoja zametka te njegova gubitka vijabilnosti. Razvoj i vijabilnost humanih gameta i zametaka u in vitro uvjetima tijekom kultivacije može biti ugrožena već malim promjenama okoliša u temperaturi ili pH. Uspostavljanjem optimalnih uvjeta kultivacije povećava se stupanj implantacije i smanjuje se stupanj pobačaja.
Noviji pristup definiranju uvjeta za predimplantacijski uzgoj humanih zametaka in vitro temelji se na spoznajama o specifičnom metabolizmu humanih zametaka u tom razdoblju, s jedne, i posebnosti prirodnog okoliša oplodnje i implantacije, s druge strane. Rezultat je definicija specifičnih formula hranilišta za gamete i zametke. Sekvencijski mediji prilagođeni su specifičnim promjenama u metabolizmu humanih zametaka tijekom ranoga predimplantacijskog razvoja. U prvih nekoliko dioba humanog zametka ATP nastaje anaerobno iz piruvata i laktata. Poslije se dominantno odvija glikoliza uz potrošak O2. Uporabom sekvencijskih medija moguće je postići razvoj 50% humanih zametaka do stupnja blastociste.



Produženom kultivacijom zametaka do stadija blastociste moguće je odabrati najvijabilniji zametak s najvećim potencijalom za implantaciju. Samo polovina svih oplođenih jajnih stanica (zigota) ima potencijal razvoja do stadija blastociste. Najčešći uzrok nerazvijanja zametaka do stadija blastociste jesu aneuploidije. Kultivacijom zametaka do stadija blastociste ne uklanjaju se zametci s kromosomskim nepravilnostima jer je i do 50% blastocista aneuploidno. Razvojne greške zametka najčešće su povezane sa zastojem u diobi i kromosomskim nepravilnostima. Iznimno je bitno odrediti zdravu blastocistu za uspješan prijenos blastociste u maternicu, pa stoga sustav ocjenjivanja mora uzeti u obzir stupanj ekspandiranosti blastociste, stadij izlijeganja, razvoj embrionalnog čvorića, kao i razvoj stanica trofoektoderma.

Prednosti razvoja blastociste u embriološkom laboratoriju su slijedeće: (I) sinkronizacija razvoja zametaka in vitro s promjenama koje se događaju u jajovodima i maternici in vivo što povećava vjerojatnost implantacije, a istodobno smanjuje potrebu vraćanja više zametaka tijekom prijenosa u maternicu,  (II) određivanje vijabilnosti zametaka in vitro u vremenu kada su morfološke i biokemijske promjene zametka upravljane aktiviranim genomom zametka, a ne signalima naslijeđenim preko jajne stanice, (III) smanjeno izlaganje zametaka hiperstimuliranom okolišu maternice, (IV) prepoznavanje zametaka koji imaju slab potencijal razvoja (usporen razvitak ili degeneracija u uvjetima izvan tijela) te selekciju najvitalnijih zametaka prema metabolizmu (promjena biokemijskog sastava hranjivog medija tijekom kultivacije), (V) povećana sposobnost blastocista za preživljavanjem kriopohrane, i (VI) smanjenje stupnja pobačaja.

Pravilan odabir zametaka s najvećim potencijalom implantacije je izrazito bitan za uspjeh izvantjelesne oplodnje. Tijekom prijenosa zametaka u materište vraćaju se najčešće do dva po kvaliteti najbolja zametka. Prema preporukama Europskog udruženja za humanu reprodukciju i embriologiju (ESHRE) stimulira se vraćanje samo jednog zametka. Prijenos jednog zametka (od eng. single embryo transfer, SET) kod odabranih grupa pacijenata preporuča se kao jedini efikasan način smanjenja učestalosti blizanačkih trudnoća. Prijenos jednog zametka dobre kvalitete od barem dva dostupna može značajno smanjiti stopu blizanačkih trudnoća. Primjena SET-a moguća je samo u kombinaciji visoko kvalitetnog laboratorija i dobrog programa krioprezervacije.
       
Glavni cilj embriološkog laboratorija je pružiti dobru uslugu svojim pacijentima, a za njih je to rođenje živog i zdravog djeteta. Nema sumnje da uspjeh metoda izvantjelesne oplodnje prvenstveno ovisi o pažljivo kontroliranim uvjetima pri svakodnevnom radu kliničkih embriologa u embriološkom laboratoriju. Osim uspostave optimalnih uvjeta kultivacije u embriološkom laboratoriju putem kontrole kvalitete koja obuhvaća djelovanja poduzeta za kontrolu hranilišta, potrošnog materijala, opreme i okoliša, uspješnost IVF postupka u ljudi ovisi i o mnogim drugim čimbenicima kao što je odabir stimulacije u pacijentice koja će utjecati na kvalitetu jajnih stanica i na receptivnost endometrija. Uvođenjem osiguranja kvalitete i kontrole kvalitete u embriološkom laboratoriju postižu se optimalni laboratorijski uvjeti rada, a eventualne nepravilnosti koje dovode do smanjena stupnja oplodnje moguće je vrlo brzo uočiti. Uočavanje problema preko kontrole kvalitete vodi poboljšanju radnog procesa u embriološkom laboratoriju, što je izrazito bitno prije nego određena nepravilnost u radu postane značajna te na taj način umanji dobru uslugu pacijentima. Osim toga, osiguranje kvalitete i kontrola kvalitete u embriološkom laboratoriju je vrlo bitna pri uvođenju novih tehnologija i metodologija koje omogućuju bolju kvalitetu u radu laboratorija.


PRAKTIČNI DIO

IVF/ET je metoda oplodnje izvan tijela i prijenos zametaka u maternicu. Priprema jajnih stanica za postupke oplodnje uz biomedicinsku pomoć laboratorijski započinje njenim izoliranjem iz folikulinske tekućine dobivene aspiracijom folikula neposredno prije ovulacije u spontanom ili stimuliranom ciklusu. Isprana jajna stanica s koje je djelomično uklonjen sloj granuloza stanica pohranjuje se u posudi s hranilištem u inkubator barem 1 sat prije primjene bilo koje od metoda oplodnje. Vrijeme ovisi o zrelosti jajne stanice i potrebno je za dovršenje njenog dozrijevanja. Nakon vremena potrebnog za dozrijevanje (jedan do četiri sata) jajne stanice se inseminiraju progresivno pokretnim spermijima. Osamnaest sati nakon inseminacije nalaz dva pronukleusa i dva polarna tjelešca u jajnoj stanici je znak uspješne izvantjelesne oplodnje. Oplodnja ovisi o zrelosti jajne stanice, kvaliteti spermija, strukturi zone pellucide, genetskim osobinama spolnih stanica te o životnoj dobi partnera. Stanična kultura zigota nastavlja se promjenom hranilišta te praćenjem razvoja zametaka.
ICSI je metoda izvantjelesne oplodnje u kojoj se jedan spermij unosi u citoplazmu jajne stanice svladavanjem bifazne barijere koju čine zona pellucida i stanična membrana jajne stanice. ICSI postupak smatra se metodom izbora kod pacijenata s teškim oblicima oligoasthenoteratozoospermije, u slučajevima azoospermije kada se spermiji dobivaju mikrokirurškim postupcima iz pasjemenika ili sjemenika, kod prisutnosti protuspermalnih protutijela te u slučajevima niske stope oplodnje unatoč dobroj kvaliteti ejakulata. Čuvanje i pohrana gameta i zametaka na jedan duži vremenski period uz zadržavanje njihove funkcionalnosti ima važnu primjenu u metodama MPO-a. Glavni razlog kriopohrane gameta je očuvanje plodnosti u pacijenata, a zametaka smanjenje višeplodnih trudnoća nakon postupaka izvantjelesne oplodnje.

Literatura:
Gardner DK. In vitro fertilization: a practical approach. Informa Healthcare, New York, 2006.
Maćaš E. Medicinski pomognuta oplodnja u čovjeka.Hinus, Zagreb, 2004.
Nagy ZP, Varghese AC, Agarwal A. Clinical embryology: a practical guide. Springer, New York, 2013.
Stanić P. Postupci u embriološkom laboratoriju. U: Reprodukcijska endokrinologija i neplodnost. Medicinski pomognuta oplodnja i IVF. Školska knjiga, Zagreb, 2012.
World Health Organization. Laboratory Manual for the Examination of Human Semen. World Health Organization, Geneva, 2010.